浅谈基因测序

1869年,Friedrich Miescher 发现和分离出脱氧核糖核苷酸,人类对生命的研究开始向分子方向启程,自1977年Sanger发明了双脱氧链终止法一代测序技术开始,涌现出GS FLX,Solexa,SOLID,PicBio,Oxford Nanopore Technologies(ONT)多种测序平台,测序技术发展至今已有四十多年时间,而每次新兴平台的出现,无不显现出生物领域人类文明的又一次大的向前迈步,是人类科技奋斗史中的里程碑。而也正是一代代测序技术的发展和我们一代代科学家不断努力,测序技术被不断应用于基因组组装,功能基因定位,进化分析,育种以及精准医疗等领域,为人类的生活带来一次次便利的同时也带来了无限可能。

第一代测序技术应用了Sanger双脱氧链终止法,它的读长可达1000bp,准确率高达99.999%,但测序前需要对特定区段进行引物设计且通量低,很难应用于组学方面的研究。基于此特点,涌现出二代测序技术,它主要的特点为短读长,高通量。以Illumina?Solexa为例,它采用边测序边合成的方法,首先利用超声波将DNA打断成200-500bp小片段文库,加接头后DNA片段随机附着于flowcell表面,经过桥式PCR扩增形成“DNA簇”,实现碱基信号强度放大,采用边合成边测序的方法,进行全基因组全面,准确的测序。

 

图1? NovaSeq 6000

百迈客目前主要应用2017年Illumina平台推出的NovaSeq系列测序平台,虽然较于以往二代平台,它的测序质量值、Index的测序识别、DNA文库冗余度等指标有了明显提升,但无法克服短读长的reads 在基因组组装、大片段变异检测、转录组、甲基化等研究中的短板。基于此情况,三代测序应运而生。

目前,三代测序的主要代表为PicBio和Oxford Nanopore Technologies(ONT)这两大测序平台,以ONT平台为例,它主要通过电信号识别碱基序列,单链DNA/RNA通过纳米孔(蛋白通道),不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号,通过对这些信号的检测,得到碱基序列,完成测序。与二代相比,它主要的优势在于在测序前,不会将DNA样品打断成小片段,而是对我们提取DNA进行片段筛选,一般筛选10-100kb大小的片段进行测序,这就对我们前期提取的DNA质量要求较高。

三代测序技术的出现,为复杂的多倍体基因组组装带来了福音。这种基因组由于倍性多,重复序列高,而二代测序局限于产生单倍体间的共有序列,导致此类物种的研究停滞不前。而ONT平台由于其长读长,跨越完整的重复区域,大的结构变异也得到了很好的检测。eg. 纳米孔测序技术可以将T-DNA结构的分辨率提升到36Kb。这就意味着,在这类突变体功能基因定位时,可以直接通过测序的方式,找到材料中T-DNA的插入位置及拷贝数,从而找到功能基因,实现基因克隆。和传统的图位克隆比较,将大大缩短定位周期。传统的自然突变材料,如果已经有定位区段,应用二代检测SNP,ONT检测SV的方式可以让我们的功能基因克隆方面事半功倍。

在基因组组装方面,以生菜基因组为例,短读长的二代测序组装出21116个contig和2.21G的基因组,基于ONT平台,则产生了1169个contig,contig N50为7.3Mb。二代数据产生了想较于三代数据18倍的contig用于基因组组装,而三代平台读长的优势为高质量的基因组组装提供了便利。在转录组研究方面,ONT平台的长读长可以为我们带来完整的转录异构体的序列,且可做定量研究,这将避免二代短片段数据在转录本组装上的错误,更好的应用于转录组研究。

ONT做为新一代测序技术,已逐渐广泛应用于科学研究中。百迈客一直致力于ONT平台的探索与研发,目前拥有MinION、GridION X5、PromethION等多种3代测序平台,且积累了丰富的项目经验,期待你的加入哦~

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